Efter den kryobeskyttende perfusion sænkes patienten ikke blot direkte ned i flydende nitrogen.
Patientens temperaturforløb styres af et computerprogram over flere dage. Sensorer i patienten viser, om kroppens forskellige områder køles ensartet ned, eller om der opstår farlige temperaturforskelle mellem dem.
Den tekniske udfordring skifter karakter undervejs i nedkølingen. I den tidlige fase skal iskrystaldannelse begrænses. Nær og under glasovergangen bliver præcision og termisk ensartethed vigtigere end hastighed.
Hvorfor styret nedkøling er nødvendig
Kryobeskyttende midler sænker den nedkølingshastighed, der er nødvendig for at undgå is. De gør det muligt for det vandrige væv at gå over i en meget viskøs, glaslignende tilstand i stedet for at krystallisere i stort omfang.
Glasovergangstemperaturen, Tg, afhænger af opløsningen, dens koncentration og den anvendte målemetode. Det er et interval, ikke én universel biologisk grænse.
For opløsninger, der anvendes til kryopræservering af mennesker, ligger temperaturintervallet typisk mellem -120 °C og -135 °C.
Over dette temperaturinterval kan for langsom nedkøling give iskrystaller mulighed for at dannes og vokse. Under det bliver materialet gradvist mere sprødt som et fast stof.
Hvis overfladen køler betydeligt hurtigere end kernen, trækker de forskellige områder sig sammen i forskelligt omfang. De termomekaniske spændinger, der opstår, kan føre til revner.
Det kræver en snæver balance: Patienten skal køles hurtigt nok ned før vitrifikationen, hvorefter temperaturforskelle og nedkølingshastighed skal styres, mens vævet bliver glaslignende.
Læs om forskellen mellem frysning og vitrifikation og den underliggende faseovergang.
Den første generation af kølekasser
Den første generation fra Tomorrow.bio, V1-kølekassen, dannede grundlag for den styrede nedkøling af hele kroppen.
Patienten placeres i et særligt isoleret kammer. En computer regulerer temperaturen i kammeret, mens termoelementer måler temperaturen flere steder i patienten.
Styringsenheden følger en programmeret kurve i stedet for at køre med maksimal nedkøling hele tiden. Målingerne fra hver sensor registreres som en del af patientens temperaturforløb.
Det er allerede grundlæggende anderledes end direkte nedsænkning. Systemet kan sænke hastigheden, holde temperaturen eller ændre forholdene i kammeret afhængigt af, hvordan patientens temperatur udvikler sig.
Andengenerationssystemet med Dewar-beholder
I andengenerationsdesignet fra Tomorrow.bio foregår den styrede nedkøling i en specialbygget Dewar-beholder.
Patienten forbliver i Dewar-beholderen, mens et specialbygget låg rummer udstyr til nedkøling og computerstyring samt ventiler, sensortilslutninger og gennemføringer til termoelementer.
Termoelementer er placeret flere steder i patienten. Yderligere sensorer overvåger temperaturforholdene i Dewar-beholderen.
Systemet registrerer derfor mere end den ønskede setpunkttemperatur. Det viser, hvor hurtigt temperaturen ændrer sig i patientens forskellige målte områder.
Computeren regulerer temperaturen i Dewar-beholderen og nedkølingshastigheden, så målingerne holder sig inden for protokollens tilladte grænser.
En stor krop kan ikke være fuldstændig isoterm under nedkøling. Det praktiske mål er at minimere spredningen og forhindre, at et målt område kommer farligt langt foran eller bagud.
Dewar-beholderens geometri reducerer også håndteringen mellem den styrede nedkøling og den kryogene opbevaring. Den lukkede konstruktion kan skabe et stabilt og symmetrisk temperaturmiljø omkring patienten.
Setpunkttemperatur er ikke patienttemperatur
En styringsenhed kan hurtigt sænke temperaturen i omgivelserne. Den kan ikke få kernen af en menneskekrop til øjeblikkeligt at nå den samme temperatur.
Varmen skal vandre fra det dybere væv mod overfladen. Kroppens form og sammensætning, fordelingen af kryobeskyttende midler og sensorernes placering påvirker den forsinkelse, man måler.
Det er derfor, én sensor i kammeret ikke er nok. Et nominelt miljø på -130 °C beviser ikke, at hver målt del af patienten har nået -130 °C.
Styringssystemet skal tage højde for både den absolutte temperatur og forskellen mellem kanalerne. Det langsomste og hurtigste målepunkt samt den samlede temperaturspredning bidrager hver med vigtig information.
Termoelementernes kalibrering, placering og uafbrudte måling spiller også en rolle. Usandsynlige målinger eller sensorfejl skal markeres og ikke blot udjævnes i temperaturkurven.
Tomorrow.bios tretrinsprogram for temperatur
Den nuværende protokol har tre distinkte faser. Værdierne er driftsmål for netop dette udstyr og denne kryobeskyttende metode, ikke universelle konstanter for alle vitrifikationssystemer.
1. Hurtig nedkøling mod -130 °C
I den første fase køles patienten fra tørisens temperatur mod cirka -130 °C så hurtigt, som den målte temperaturspredning forsvarligt tillader.
Hastighed er afgørende her, fordi utilstrækkeligt beskyttede områder stadig kan danne is, før vævet bliver glaslignende.
Computeren følger ikke blot den forløbne tid. Den overvåger termoelementerne og justerer nedkølingsmiljøet omkring patienten.
2. Styret opvarmning mod -120 °C
Når temperaturen har nået cirka -130 °C, reduceres den aktive nedkøling, så patienten gradvist varmes op mod cirka -120 °C.
Dette er en annealing-fase. Tæt på Tg har det kryobeskyttede materiale stadig nok molekylær bevægelighed til, at en del af den ophobede mekaniske spænding kan udlignes.
Opvarmningen giver også de varmere og koldere områder tid til at nærme sig samme temperatur, før materialet nedkøles yderligere til en stiv, glaslignende tilstand.
Annealing kan ikke ophæve tidligere biologiske skader. Formålet er mere afgrænset: at reducere termiske gradienter og de spændinger, der opstår ved ujævn sammentrækning.
3. Nedkøling til -196 °C ved cirka 1 °C i timen
Fra omkring -120 °C er målet at køle med cirka 1 °C i timen, indtil patienten når temperaturen i flydende nitrogen.
Det sidste interval på 76 grader tager omkring tre dage, og det er før ophold og styringsjusteringer medregnes.
At holde 1 °C i timen i en stor krop med betydelige temperaturforskelle er en reguleringsopgave, ikke blot en timerindstilling.
Styringsenheden skal løbende justere temperaturen i Dewar-beholderen, så temperaturerne ved de interne termoelementer falder ensartet, uden at der opstår for store temperaturforskelle.
Hvis ét område køles langsommere end resten, kan en lavere omgivelsestemperatur få et andet område til at blive for koldt. Præcision betyder at afbalancere hele sensorfeltet, ikke at jagte en enkelt aflæsning.
Hvorfor annealing-fasen er videnskabeligt plausibel
Forskning i vitrifikation i stor skala peger på to konkurrerende risici: utilstrækkelig nedkøling over Tg og for store mekaniske spændinger omkring og under Tg.
Et studie fra 2024 om vitrifikation i organstørrelse anvendte flere interne sensorer og konkluderede, at annealing reducerer temperaturforskelle, før materialet når glasfasen.
Det samme studie fandt, at langsom nedkøling under annealing-intervallet kan modvirke, at store temperaturforskelle og spændinger opbygges igen.
En separat termomekanisk undersøgelse viste, at annealing tæt på Tg ændrer den resterende spænding markant og gør den mindre afhængig af den foregående nedkølingshastighed.
Disse studier understøtter den overordnede reguleringsstrategi. De bekræfter dog ikke uafhængigt hvert enkelt setpunkt i Tomorrow.bios protokol for hele kroppen.
Hele menneskekroppe er større og mere uensartede end laboratorieopløsninger eller organer. Direkte temperaturregistreringer og billeddannelse efter nedkøling er stadig nødvendige.
Hvad computeren registrerer
Det afgørende resultat er ikke blot en meddelelse med teksten “nedkøling gennemført”. Det er hele tidsserien fra samtlige temperaturkanaler.
Dokumentationen bør omfatte nedkølingshastigheder, ophold, opvarmninger, temperaturforskelle mellem sensorer, styringsenhedens handlinger, alarmer og enhver afvigelse fra den planlagte kurve.
Disse data bliver en del af kvalitetsvurderingen af kryopræserveringen.
Efter nedkølingen kan en standardiseret CT-scanning ved temperaturen i flydende nitrogen undersøge fordelingen af kryobeskyttende midler, is, større deformationer og brud, som temperaturdata alene ikke kan afdække.
Hvorfor afslutte ved temperaturen af flydende nitrogen
Ved normalt atmosfærisk tryk koger nitrogen ved omkring 77,34 kelvin, cirka -195,8 °C, ifølge NIST Chemistry WebBook.
Opbevaring i flydende nitrogen kræver ikke aktiv mekanisk køling. Så længe beholderen indeholder tilstrækkeligt flydende nitrogen, holdes temperaturen stabil omkring nitrogenets kogepunkt uden mekanisk køling.
Den styrede nedkøling afsluttes først, når patientens temperaturfordeling er egnet til den stabile opbevaringstilstand. Opbevaring bruges ikke som erstatning for nedkøling.
Konstruktionen og de afvejninger, der gælder i næste trin, beskrives under moderne kryogene Dewar-beholdere og opbevaring ved mellemtemperatur.
Kort fortalt: Tomorrow.bio anvender computerstyret nedkøling og interne temperatursensorer. Processen indebærer først hurtig nedkøling mod glasdannelsen, derefter udligning af termisk spænding og til sidst langsom nedkøling mod -196 °C.
Udforsk dette praktiske værktøj
Brug det interaktive værktøj til at udforske spørgsmålet i denne artikel.
Indlæser det interaktive værktøj...
Yderligere læsning